პროდუქტები

ევკარიოტული უჯრედები შეიცავს ოთხი დეზოქსირიბონუკლეოზიდის ტრიფოსფატის (dNTPs) მცირე რაოდენობით დელიკატურ ბალანსს, რაც საკმარისია დნმ-ის რეპლიკაციისთვის მხოლოდ რამდენიმე წუთის განმავლობაში.ერთი dNTP-ის დეფიციტმაც და ჭარბმაც შეიძლება გამოიწვიოს მუტაციის სიხშირის გაზრდა, დნმ-ის გაუმართავი შეკეთება ან მიტოქონდრიული დნმ-ის დაქვეითება.dNTP-ები ჩვეულებრივ რაოდენობრივად ფასდება ფერმენტული ანალიზით, რომელშიც რადიოაქტიური dATP-ის (ან რადიოაქტიური dTTP-ის ანალიზში dATP-ის ანალიზში) ინკორპორაცია დნმ პოლიმერაზას მიერ სპეციფიკურ სინთეზურ ოლიგონუკლეოტიდებში პროპორციულია უცნობი dNTP-ის კონცენტრაციისა.ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ხშირად გამოყენებული Klenow დნმ პოლიმერაზამ შეიძლება შეცვალოს შესაბამისი რიბონუკლეოტიდი უცნობი dNTP-ით, რაც ზოგიერთ შემთხვევაში იწვევს dNTP-ების დიდ გადაფასებას.ჩვენ ახლა აღვწერთ ანალიზის პირობებს თითოეული dNTP-სთვის, რომელიც თავიდან აიცილებს რიბონუკლეოტიდის ინკორპორაციას.dTTP და dATP ანალიზებისთვის საკმარისია კლენოუს ფერმენტის და ეტიკეტირებული dATP-ის (ან dTTP) კონცენტრაციების მინიმუმამდე შემცირება;dCTP-სთვის და dGTP-სთვის ჩვენ უნდა შეგვეცვალა კლენოვის ფერმენტი Taq დნმ პოლიმერაზათ ან თერმო სეკვენაზათ.ჩვენ ვარაუდობთ, რომ ზოგიერთ ადრეულ მოხსენებაში რიბონუკლეოტიდის ინკორპორაციამ შეიძლება გამოიწვიოს dGTP და dCTP ძალიან მაღალი მნიშვნელობები.