ახალი ამბები

IPTG (იზოპროპილ-β-D-თიოგალაქტოზიდი) არის β-გალაქტოზიდაზას სუბსტრატის ანალოგი, რომელიც ძლიერ ინდუცირებადია.IPTG-ის ინდუქციით, ინდუქტორს შეუძლია შექმნას კომპლექსი რეპრესორულ ცილასთან, ისე, რომ შეიცვალოს რეპრესორის ცილის კონფორმაცია, ისე, რომ ის არ იყოს შერწყმული სამიზნე გენთან და სამიზნე გენი ეფექტურად გამოხატული იყოს.მაშ, როგორ უნდა განისაზღვროს IPTG-ის კონცენტრაცია ექსპერიმენტის დროს?რაც უფრო დიდია მით უკეთესი?
ჯერ გავიგოთ IPTG ინდუქციის პრინციპი: E. coli-ს ლაქტოზას ოპერონი (ელემენტი) შეიცავს სამ სტრუქტურულ გენს Z,Y და A, რომლებიც კოდირებენ შესაბამისად β-გალაქტოზიდაზას, პერმეაზას და აცეტილტრანსფერაზას.lacZ ჰიდროლიზებს ლაქტოზას გლუკოზასა და გალაქტოზაში, ან ალო-ლაქტოზაში;lacY საშუალებას აძლევს გარემოში არსებულ ლაქტოზას გაიაროს უჯრედის მემბრანა და შევიდეს უჯრედში;lacA გადააქვს აცეტილის ჯგუფს აცეტილ-CoA-დან β-გალაქტოზიდამდე, რაც გულისხმობს ტოქსიკური ეფექტის მოცილებას.გარდა ამისა, არსებობს ოპერაციული თანმიმდევრობა O, საწყისი თანმიმდევრობა P და მარეგულირებელი გენი I. I გენის კოდი არის რეპრესორული ცილა, რომელსაც შეუძლია დაუკავშირდეს ოპერატორის თანმიმდევრობის O პოზიციას, ასე რომ ოპერონი (მეტა) რეპრესირებულია და გამორთული.ასევე არსებობს კატაბოლური გენის აქტივატორის პროტეინ-CAP-ის შემაკავშირებელი ადგილის დამაკავშირებელი ადგილი საწყისი P რიგითობის ზემოთ. P თანმიმდევრობა, O თანმიმდევრობა და CAP შეკავშირების ადგილი ერთად ქმნიან lac ოპერონის მარეგულირებელ რეგიონს.სამი ფერმენტის კოდირების გენები რეგულირდება იმავე მარეგულირებელი რეგიონით, რათა მიაღწიოს გენის პროდუქტების კოორდინირებულ ექსპრესიას.

ლაქტოზის არარსებობის შემთხვევაში ლაქტოზას ოპერონი (მეტა) რეპრესიულ მდგომარეობაშია.ამ დროს PI პრომოტორული თანმიმდევრობის კონტროლის ქვეშ I თანმიმდევრობით გამოხატული lac რეპრესორი აკავშირებს O თანმიმდევრობას, რაც ხელს უშლის რნმ პოლიმერაზას P თანმიმდევრობას და აფერხებს ტრანსკრიპციის დაწყებას;როდესაც ლაქტოზა არსებობს, ლაქტოზას (მეტა) გამოწვევა შეიძლება. ამ ოპერონის (მეტა) სისტემაში რეალური ინდუქტორი არ არის თავად ლაქტოზა.ლაქტოზა შედის უჯრედში და კატალიზდება β-გალაქტოზიდაზას მიერ, რათა გარდაიქმნას ალოლაქტოზაში.ეს უკანასკნელი, როგორც ინდუქტორი მოლეკულა, უკავშირდება რეპრესორულ ცილას და ცვლის ცილის კონფორმაციას, რაც იწვევს რეპრესორის ცილის დისოციაციას O თანმიმდევრობიდან და ტრანსკრიფციაში.იზოპროპილთიოგალაქტოზიდს (IPTG) აქვს იგივე ეფექტი, რაც ალოლაქტოზას.ეს არის ძალიან ძლიერი ინდუქტორი, რომელიც არ მეტაბოლიზდება ბაქტერიებით და ძალიან სტაბილურია, ამიტომ ფართოდ გამოიყენება ლაბორატორიებში.

როგორ განვსაზღვროთ IPTG-ის ოპტიმალური კონცენტრაცია?მაგალითისთვის ავიღოთ E. coli.
E. coli BL21 გენეტიკურად ინჟინერირებული შტამი, რომელიც შეიცავს დადებით რეკომბინანტულ pGEX-ს (CGRP/msCT) იყო ინოკულირებული LB თხევადი გარემოში, რომელიც შეიცავდა 50 μg·mL-1 Amp და კულტივირებული იყო ღამით 37°C-ზე.ზემოაღნიშნული კულტურა ინოკულირებული იყო 10 ბოთლში 50 მლ ახალი LB თხევადი გარემოში, რომელიც შეიცავდა 50 μg·mL-1 ამპერს 1:100 თანაფარდობით გაფართოების კულტურისთვის და როდესაც OD600 მნიშვნელობა იყო 0.6-0.8, IPTG დაემატა საბოლოო კონცენტრაციას.ეს არის 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 მმოლ·ლ-1.იმავე ტემპერატურაზე და იმავე დროს ინდუქციის შემდეგ, მისგან აიღეს 1 მლ ბაქტერიული ხსნარი, ბაქტერიული უჯრედები შეგროვდა ცენტრიფუგირებით და დაექვემდებარა SDS-PAGE-ს, რათა გაანალიზდეს სხვადასხვა IPTG კონცენტრაციის გავლენა ცილის ექსპრესიაზე, და შემდეგ აირჩიეთ IPTG კონცენტრაცია ყველაზე დიდი ცილის ექსპრესიით.
ექსპერიმენტების შემდეგ აღმოჩნდება, რომ IPTG-ის კონცენტრაცია არ არის რაც შეიძლება დიდი.ეს იმიტომ ხდება, რომ IPTG-ს აქვს გარკვეული ტოქსიკურობა ბაქტერიების მიმართ.კონცენტრაციის გადაჭარბება უჯრედსაც მოკლავს;და ზოგადად რომ ვთქვათ, ჩვენ ვიმედოვნებთ, რომ რაც უფრო მეტი ხსნადი ცილაა გამოხატული უჯრედში, მით უკეთესი, მაგრამ ხშირ შემთხვევაში, როდესაც IPTG-ის კონცენტრაცია ძალიან მაღალია, წარმოიქმნება დიდი რაოდენობით ინკლუზია.სხეული, მაგრამ ხსნადი ცილის რაოდენობა შემცირდა.ამიტომ, ყველაზე შესაფერისი IPTG კონცენტრაცია ხშირად არ არის რაც უფრო დიდი, მით უკეთესი, მაგრამ რაც უფრო დაბალია კონცენტრაცია.
გენმოდიფიცირებული შტამების ინდუქციისა და კულტივირების მიზანია სამიზნე ცილის მოსავლიანობის გაზრდა და ხარჯების შემცირება.სამიზნე გენის ექსპრესიაზე გავლენას ახდენს არა მხოლოდ შტამის საკუთარი ფაქტორები და ექსპრესიის პლაზმიდი, არამედ სხვა გარე პირობებიც, როგორიცაა ინდუქტორის კონცენტრაცია, ინდუქციის ტემპერატურა და ინდუქციის დრო.ამიტომ, ზოგადად, უცნობი ცილის ექსპრესირებამდე და გაწმენდამდე, უმჯობესია შევისწავლოთ ინდუქციის დრო, ტემპერატურა და IPTG კონცენტრაცია, რათა შევარჩიოთ შესაბამისი პირობები და მივიღოთ საუკეთესო ექსპერიმენტული შედეგები.